截留分子量选小啦！看到这个表，你是否发现原来抱怨Millipore超滤管流速偏慢的根源来自对于Millipore截留分子量定义的误解。膜孔径要小于目的分子这是第一原则。如果分子有近似球形的立体结构(而非明显的线性分子)，在Millipore再生纤维素超滤膜体系内，选择“等于”或“略小于”目的分子的截留分子量的超滤管是最佳选择，这样操作起来又快又好，既保证了样品回收率，又缩短了离心时间，大幅降低大分子损伤风险。

Amicon® Ultra系列超滤管产品需要根据起始样品体积、目标蛋白或核酸的分子量、终体积及浓缩倍数等选择具体型号。下表为选择最适合截留分子量的超滤管提供了一些参考建议。

收取体积已经很小的浓缩好的样品时，你会：

A 购买最尖细的枪头，把样品吸回来 

B 浓缩倍数低一点，以便用枪头把样品吸回来

C 反转离心回收，获得最高得率


正确答案“C”,你答对了么？
Millipore的Amicon® Ultra系列超滤管上样体积有0.5/2/4/15/70mL等五种，除了采用低吸附的管材和最低蛋白吸附的再生纤维素超滤膜，其中0.5mL，2mL和70mL的规格还特别设计了反转回收模式，以便使已经浓缩的样品最大化回收。

现在你总该知道为什么收到AU0.5的时候会有两个外管了吧～

更多关于超滤管的正确使用问题：

• 蛋白在浓缩时出现了沉淀，如何改进？

  蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白，建议的改进方法是：

  1）离心力降为推荐离心力的30%-50%

  2）改用截留分子量更大的超滤管（如原本选用10k，此时可以选择30k） 

  3）在浓缩过程中取出超滤管，用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩

  4）体积较大的样品可考虑选用搅拌式超滤杯，减少沉淀的发生。

• Amicon® Ultra超滤管可以用酒精消毒灭菌么？

  Amicon® Ultra与70%乙醇是兼容的，但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试，所以无法提供更进一步的参考信息。建议采用Ultrafree无菌离心管对浓缩后的样品进行过滤除菌。

• Amicon® Ultra超滤装置是否可以用于高压灭菌？

  Amicon® Ultra都是采用热封设计，不可以用高压高温灭菌。

• 怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附，如何改善？ 

  Amicon® Ultra超滤管使用的是再生纤维素膜，这种材质是蛋白吸附最低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白，它们和膜的非特异吸附可能会增强。对于这种情况，可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理，也可以尝试换成Amicon® Ultra 0.5或2来进行实验，通过减小膜面积来降低非特异性吸附。

• 有时候用超滤离心管连水都离不下来，可能是什么原因？

  Amicon® Ultra超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况，请先用0.1 N NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。

• 如果要用超滤的方法分离两种蛋白，那么这两个蛋白的大小需要相差多少？

  按照经验，建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级（10倍）。

• 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到蛋白的稳定性，是否可以在4℃进行离心？

  可以，但是低温会增加蛋白样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。
  

• 浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白，可能的原因有哪些？

  首先，Amicon® Ultra超滤管的蛋白最低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次，如果问题仍然出现，请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因：

  1）如果目的样本在滤过液中，那么请排查：

    a） 是否选择了合适截留分子量的超滤管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？

    b）使用的离心力是否是在限定范围内？如果使用的是rpm，请换算成相应的g离心力，具体换算方法请垂询。

    c）离心机最近是否有校准过？

    d）是否首次尝试这个蛋白？如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话，那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性（构象差异）而影响浓缩效果，建议选用更小截留分子量的超滤管（如原本选用30k，此时可以选择10k）

  2）如果目的样本也不在滤过液中，那么：

    a）蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL？

    b）用来确定样本浓度的方法是什么？是否可信？

    c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。

TIPS

👍 快速大体积样品超滤请选用Centricon Plus-70mL离心超滤管

👍 温和而经济的Amicon搅拌式超滤杯(50/200/400mL)，可以满足1L以内的样品浓缩脱盐和膜通量测试。

👍 透析脱盐换液请选用D-tube透析管(300uL～15mL)，温和脱盐换液，标准枪头操作。

👍 核酸/法医/质谱样品制备/药物结合分析等请选用Microcon超滤管(0.5mL)，横膜设计，没有死体积，医药级O形圈。