【关键词】 高效液相色谱

　　摘要  以1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯为衍生化试剂, 在充氮的气氛下对鱼油进行皂化处理, 所得皂化产物经正己烷萃取处理后进行柱前衍生化, 再以HPLC/MS分离和鉴定。通过对长链脂肪酸分子的标记处理, 其衍生物分子在质谱分析中呈现出双键位置的规范信息。通过建立模型计算式, 借助不饱和脂肪酸的分子离子峰和特征碎片离子峰的质量数, 计算不饱和的碳碳双键位置。共鉴定出23种脂肪酸。结果表明: 深海鱼油主要由C12C22的脂肪酸组成, 多不饱和脂肪酸含量占67.08% (峰面积百分比,下同), 其中C16∶19十六碳烯酸 (11.7%); C16∶44, 7, 10, 13十六碳四烯酸 (2.91%); C18∶112十八碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15十八碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十碳五烯酸 (16.71%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十二碳六烯酸 (10.53%)。所建立的方法为不饱和脂肪酸碳链中双键位置的确定提供了新的技术手段。

　　关键词  高效液相色谱质谱, 柱前衍生, 鱼油, 脂肪酸, 双键位置

　　1  引言

　　脂肪酸广泛分布于自然界中，是生物体内重要的营养和代谢产物，对调节生物体内各项生理和生物功能起着重要作用。尤其多不饱和脂肪酸的结构特征与生理功能的关系倍受关注。油脂中脂肪酸的GC/EIMS分析常采用甲酯或三甲基硅烷化，但该法不能确定多不饱和脂肪酸中碳碳双键的位置，因为在电子轰击下，双键沿脂肪酸链明显迁移[1～3]。本实验通过柱前衍生以液相色谱/质谱（LC/MS/APCI）研究皂化后的深海鱼油中脂肪酸的组成，用1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯 (BDEBS)作脂肪酸的柱前衍生试剂[4,5]，采用软离子化检测技术(大气压化学电离源，APCI) 解析了脂肪酸衍生物的相关质谱信息，确定了深海鱼油中多不饱和脂肪酸的碳碳双键的位置。所建立的方法可望在医药、食品、生命科学等领域获得广泛应用。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂Agilent1100型高效液相色谱质谱联用仪(Agilent公司)，配备四元梯度泵、100位自动进样器、荧光检测器和在线真空脱气机；Agilent 1100 Series LC/MSD Trap，配备大气压化学电离源 (APCI)。1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯(自制，见文献[4,5])；长链饱和及不饱和脂肪酸标准样品(Sigma公司)；无水乙腈 (禹城化学试剂厂)用P2O5干燥后蒸馏处理,用于制备缓冲溶液的甲酸、氨水等均为分析纯。纯水由MilliQ超纯水系统制备。

　　2.2  标准溶液的配制准确称取定量脂肪酸标品，用光谱纯乙腈配成1.0×10-2  mol/L的溶液（长链脂肪酸需加入少量DMF作为助溶剂）。称取0.0404 g的1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯用DMF定容至10 mL，浓度为5.0×10-2 mol/L。相应低浓度的衍生试剂(5.0×10-3 mol/L)及低浓度脂肪酸(1.0×10-4 mol/L)的标准溶液分别用DMF和光谱纯乙腈稀释而成。

　　2.3  深海鱼油的皂化和衍生 鱼油皂化参考文献[6]。取100 mg 深海鱼油于具塞试管中，加入1.0 mL 2 mol/L KOH的乙醇溶液，充氮密封后，在100℃水浴反应0.5 h，取出冷却至室温。滴加2.0 mol/L HCl至pH 2.0,加入500 μL正己烷超声处理2 min，静止分层，用注射器吸掉水层后，用去离子水洗至pH 7.0。氮气吹干，残余物重新溶解在500 μL的乙腈中。向盛有10 mg无水K2CO3催化剂的2 mL安培瓶中依次加入180 μL DMF，50 μL混合脂肪酸的提取样，120 μL衍生试剂溶液(5.0×10-3 mol/L)，封口后于85℃恒温水浴下振荡反应45 min，取出放冷后, 加入1000 μL乙腈水溶液（CH3CN/H2O,1∶1, Ｖ/Ｖ）稀释后进样10 μL分析。衍生反应概况如图1所示。

　　2.4  色谱与质谱条件Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5  μm，大连依利特公司)。流动相A: 50％乙腈水溶液内含30 mmol/L的甲酸/氨水缓冲液 (pH3.5)；B: 100％的乙腈。梯度条件：40 min由A到B (B保持10 min),流速为1.0 mL/min, 进样量为10 μL，柱温30℃。荧光激发和发射波长分别为333和390 nm。大气压化学电离源（APCI）：正离子检测模式，喷雾压力60 p.s.i (1p.s.i=6894.76 Pa)，干燥气流量为5 L/min，干燥气温度350℃，气化温度450℃，毛细管电压3500 V，电晕电流4000 nA（Pos）[5,6]。

　　图1  1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯与5,8,11,14,17二十碳五烯酸的衍生概况及质谱断裂模式(略)

　　Fig.1  Ｓcheme of derivatization procedure using 1,2benzo3,4dihydrocarbazole9ethylbenzenesulfonate (BDEBS) as labeling reagent; and the profile of collisioninduced dissociation of representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5)

　　2.5  理论部分（双键位置判定）借助质谱分析中所获得的衍生物分子所对应的分子离子峰的质量数[MH]+（图1所示），可推出公式 (1)～(7)，并由此确定长链饱和及不饱和脂肪酸的碳原子数目n。饱和脂肪酸：

　　Cn∶0     MH+-1=278+CnH2n-1;      n=(MH+-278)/14(1)不饱和脂肪酸：

　　Cn∶1    MH+-1=278+CnH2n-3;        n=(MH+-276)/14(2)

　　Cn∶2    MH+-1=278 + CnH2n-5;    n=(MH+-274)/14   (3)

　　Cn∶3    MH+-1 = 278 + CnH2n-7;  n=(MH+-272)/14(4)

　　Cn∶4    MH+-1 = 278+CnH2n-9;  n=(MH+-270)/14(5)

　　Cn∶5    MH+-1 = 278 + CnH2n-11;  n=(MH+-268)/14(6)

　　Cn∶6    MH+-1 = 278 + CnH2n-13;  n=(MH+-266)/14(7)

　　公式中n为饱和及不饱和脂肪酸的碳原子数目；278为试剂分子母核结构部分的分子量；MH+ 为质谱确定的饱和及不饱和脂肪酸的分子离子峰的质量数。依据分子中双键的断裂模式见图2。有质谱分析中所获得的不饱和脂肪酸衍生物的特征碎片离子的质量数（双键断裂后产生的特征碎片离子），含1～6个碳碳双键的脂肪酸链中。

　　图2  脂肪酸衍生物中的碳碳双键的质谱裂解示意图(db: 双键; CaH2a:末端双键断裂所丢失的小分子; CbH2b-2:末端第二个双键断裂后丢失的小分子)(略)

　　Fig.2  MS cleavage profile of collisioninduced dissociation of fatty acid derivative (db: double bond; CaH2a: losing of small molecule with the cleavage of double bond at the end of molecular carbon chain)

　　的双键位置可由下列公式 (8)～(13)计算获得：

　　Cn∶1    Cdb= (M+1-276)/14                                                (8)

　　Cn∶2    Cdb1 = (M+2-276)/14;  Cdb2 = (M+1-274)/14(9)

　　Cn∶3    Cdb1 = (M+3-276)/14;  Cdb2 = (M+2-274)/14;  Cdb3 = (M+1-272)/14(10)

　　Cn∶4    Cdb1= (M+4-276)/14;  Cdb2 = (M+3-274)/14; Cdb3 = (M+2-272)/14;

　　Cdb4 = (M+1-270)/14(11)

　　Cn∶5    Cdb1 = (M+5-276)/14;  Cdb2 = (M+4-274)/14;

　　Cdb3 = (M+3-272) /14; Cdb4 = (M+2-270)/14;  Cdb5 = (M+1-268)/14(12)

　　Cn∶6    Cdb1 = (M+6-276)/14;  Cdb2 = (M+5-274)/14; Cdb3 = (M+4-272)/14;

　　Cdb4 = (M+3-270)/14;  Cdb5 = (M+2-268)/14;  Cdb6 = (M+1-266)/14(13)

　　公式中的 “dbx”; x = 1, 2,…6 代表双键在脂肪酸碳链中的位置，M＋1到 M＋6是双键断裂后产生的特征碎片离子峰的质量数，实验中涉及的长链脂肪酸的双键最大数目为6， 即 x≤6；且有：M＋1＞M+2＞M+3＞M+４＞M＋5＞M+6; 对同时含有多个双键脂肪酸的衍生物，质谱上所获得的特征碎片离子应具有M＋1－ M+2＝M＋2－M＋3＝M＋3－M+4＝M+4－M+5＝M+5－M+6＝40个质量单位，参见图1和图2。

　　3  结果与讨论

　　3.1  质谱解析质谱数据表明，所有脂肪酸衍生物表现出强烈的分子离子峰，其质量数为m/z [MH]+；分子离子碰撞裂解后产生的m/z 263.7和 245.7碎片峰为衍生试剂分子的母核结构的特征峰（见图1）。饱和脂肪酸衍生物，以C14为例（见图3）：分子离子峰 为474.1，母核结构的特征碎片离子为m/z 263.7和245.7，质谱图中显示的碎片峰相对简单。含一个碳碳双键的不饱和脂肪酸衍生物，以C18∶1为例（见图4）：分子离子峰 为m/z 528.1；失水离子峰m/z [MH]+-H2O (m/z 510.0)，表现出的特征碎片离子峰M+1，m/z 值在444.1，以及与之相邻并相差12个质量单位的特征峰m/z 456.1。与m/z 444.1相差1～2两个质量单位的碎片峰m/z 442.6 应归属于m/z 444.1的峰。依据等式 (8)，计算出被裂解双键的首碳位置为 12 (Cdb=12)。由于其高质量端与之相邻的峰为m/z 456.1，恰好相差 12 质量单位，它应归属于 C12 = C13 的裂解。

　　图3  代表性的饱和十四酸(C14∶0) 的质谱概况图 (A: MS分析; B: MS/MS分析)(略)

　　Fig.3  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of saturated tetradecanoic acid (C14, fatty acid) derivatized with BDEＢＳ as labeling agent

　　图4  以12十八碳稀酸为代表的单不饱和脂肪酸衍生物的质谱裂解示意图 (A: MS; B和C为MS/MS)(略)

　　Fig.4  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of monounsaturated 12octadecenoic acid (C18∶1, fatty acid) derivatized with BDETS as labeling reagent

　　含多个碳碳双键的不饱和脂肪酸衍生物，以C20∶5为例 （见图5）：分子离子峰 为MH+, m/z 5481；失水离子峰MH+-H2O (m/z 529.9)， 表现出的特征碎片离子峰M+1, m/z 506.1；M+2，m/z 466; M+3, m/z 425.7 (≈426); M+4, m/z 385.8 (≈386); M+5, m/z 346。这些特征碎片离子在其相邻的高质量端都有一个与之相邻的并相差12个质量单位的特征碎片峰，它们的质量数分别为m/z 517.9 (≈518); m/z 478; m/z 438; m/z 398.8 (≈400) 和m/z 358。依据等式 (6) 和 (12), 计算出被裂解双键的首碳位置分别为17(Cdb1=17)、14(Cdb2=14、11(Cdb3=11)、8(Cdb4=8)和5(Cdb5=5), 所对应的被裂解的双键位置分别为C17C18、C14C15、C11C12、C8C9和C5C6 (断裂模式见图1)。分析数据显示, 饱和脂肪酸衍生物的质谱相对简单, 不饱和脂肪酸随双键数目的增加, 质谱裂解碎片逐渐复杂, 本实验条件下, 饱和脂肪酸衍生物大都没有丢失水分子峰，仅表现出 [MH]+ 和衍生试剂母核分子的特征峰m/z 263.7和245.7; 而不饱和脂肪酸衍生物显示出特有的失水碎片峰[MH]+-H2O 和特征碎片离子峰M＋1, M＋2…M＋n（其特征峰的个数主要有双键的数目决定）。此外，对多不饱和脂肪酸而言，另一个显著性的特征是所有特征碎片离子峰M＋1, M＋2……M＋n，它们相互之间有40个质量单位的差异，即相邻的两个双键之间相差一个CHCHCH2的结构单元（见图2）。这对于判断多不饱和脂肪酸双键位置时，寻找质谱图中所显示的特征碎片离子峰M＋1, M＋2……M＋n起着至关重要的作用。它将指导对特征碎片离子峰的正确判断（有时这些特征碎片离子峰的峰度相对较低，或者与其它碎片峰相邻，正确判断存在一定难度）。对一个完全未知的组分而言，首先由质谱确定相应分子离子峰的质量数，进而由母核结构的特征碎片离子峰推断该组分是含羧酸的衍生物（其它组分在该条件下不发生衍生化，芳香酸衍生化产率很低，该条件下仅为直链脂肪酸的10%左右）。将分子离子的质量数m/z [MH]+ 代入公式 (1) 或公式 (2)～(7)进行检验，所获得的碳原子数n必需满足整数值。在此基础上寻找质谱图上显示的分子离子峰经裂解后产生的失水碎片峰[MH]+-H2O, 并由此推断是否为饱和或者不饱和脂肪酸。断定为不饱和脂肪酸后，根据计算所获得的不饱和脂肪酸的双键数目后，在质谱图上寻找相应数目的特征碎片离子峰的质量数（对含单双键的脂肪酸，借助于12个单位质量差更为容易；对多不饱和的脂肪酸，借助40个质量差的结构单元尤为重要）。

　　图  5  以5,8,11,14,17二十碳五烯酸为代表的不饱和脂肪酸衍生物的质谱裂解示意图(略)

　　Fig.5  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5) with BDEＢS as labeling reagent

　　Ａ． ＭＳ； Ｂ，Ｃ，Ｄ： ＭＳ／ＭＳ．

　　3.2  衍生条件优化及鱼油样品分离1,2苯并3,4二氢咔唑9乙基苯磺酸酯与脂肪酸的衍生化随溶剂不同衍生化产率有显著差异。实验中分别选取苯、甲苯、乙腈、N,N二甲基甲酰胺(DMF，干燥后减压蒸馏处理) 、四氢呋喃、二甲亚砜(DMSO，干燥后减压蒸馏处理)作为溶剂体系，以C16∶0、C17∶0、C18∶1、C22∶0和C20∶4长链饱和及不饱和脂肪酸为代表，考察了衍生化产率。尽管DMSO具有和DMF相当的衍生效果，然而以DMSO为溶剂时所获得的衍生物在色谱洗脱过程中导致较多的干扰峰（副反应产物多），实验中选取DMF作衍生化溶剂。磺酸酯与脂肪酸的衍生化随碱性催化剂的不同，反应产率不同，实验中选取K2CO3、K2C2O4、Na2CO3、KAc和柠檬酸钾等几种碱性催化剂，对衍生化产率进行了考察，结果表明：K2CO3和Na2CO3具有最高的衍生产率。考虑到K2CO3在DMF中具有较大的溶解力，故实验选取K2CO3。尽管衍生化产率随K2CO3用量的增加而提高，但过高的用量会导致试剂的部分分解。实验中选取K2CO3的用量为10 mg (用量约为衍生化试剂用量的30～40倍，按摩尔量计算)。对衍生化温度的考察表明：衍生化产率随温度升高而提高，超过95℃后，由于副反应的发生衍生化产率随之降低，实验中选择衍生温度为85℃，衍生化时间45 min。按前述衍生条件，经LC分离的色谱图见图6。获得的LC/MS/APCI总离子流见图7。质谱数据解析结果列于表1。由表1可见，深海鱼油主要由C12C22的饱和及不饱和脂肪酸组成，分离后不饱和脂肪酸的含量占67.08% （峰面积归一化以15到45 min内流出的各组分进行计算）。 其中C16∶19十六碳烯酸 (117%); C16∶44, 7, 10, 13十六碳四烯酸 (2.91%); C18∶112十八碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15十八碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十碳五烯酸 (1671%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十二碳六烯酸 (10.53%) 等不饱和长链脂肪酸是鱼油的主要组分。

　　图6  深海鱼油脂肪酸的色谱分离图 (峰标注见表1)(略)

　　Fig.6  Chromatogram of longchain fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)

　　图7  深海鱼油样品质谱离子流图 (峰标注见表1)(略)

　　Fig.7  MS ion chromatogram of the isolated fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)

　　表1  深海鱼油中脂肪酸衍生物的质谱解析数据(略)

　　Table 1  MS analysis of the fatty acid derivatives from deepsea fish oil sample

　　References

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　　4  You J M, Shi Y W, Ming Y F, Yu Z Y, Yi Y J, Liu J Y. Chromatographia, 2004, 60:  527～535

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　　6  Zou Yaohong(邹耀洪). Chinese J． Anal． Chem．(分析化学), 2004, 32(1): 71～75

　　本文系国家自然科学基金资助项目（No. 20075016）

　　(曲阜师范大学化学科学学院，曲阜 273165)

　　(中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001)